目前功能化的量子点(quantum dots，QDs)探针已在细胞和生物分子标记示踪、活体肿瘤成像、药物监测、信号转导和生物芯片等生物医学研究领域显示出极其重要的作用。但由于QDs核的成分为重金属(如Cd、Se等)，其生物毒性和生物安全性引起了人们的广泛关注。有研究表明：由于QDs核的重金属离子释放以及作为纳米粒的QDs具有诱导细胞产生活性氧自由基，从而对机体和细胞产生毒性作用。但另外一些研究表明：一些表面包裹有生物活性物质的功能化QDs，在体外和体内均未观察到对细胞或机体的毒性作用。已有研究证实：影响功能化QDs毒性的因素很多，包括QDs核的成分组成、粒径大小、暴露浓度、暴露时间、表面包覆材料的物理和化学性质、作用环境、给药途径和作用细胞的种类等，因而不能笼统地将功能化QDs定义为有毒或无毒，对不同类型功能化的QDs的生物毒性需要进行个体化的评价，重要的是首先要评价不同类型功能化QDs在达到医学应用目的的剂量下是无毒或有毒。近年来有研究证明：将近红外量子点(near-infrared quantum dots，NIR QDs)与RGD连接制备的NIR QD-RGD探针能与肿瘤新生血管内皮细胞表达的整合素αvβ3特异性地靶向结合，对体质量为20～25g的小鼠，每只静脉注射150～200pmol剂量的NIR QD-RGD探针能达到对体内肿瘤及肿瘤新生血管清楚的成像，对癌症的早期诊断，体内肿瘤成像和个体化治疗具有巨大的发展前景，但目前还未见NIR QD-RGD的毒性研究报道。用于临床的制剂，无论诊断和治疗，常常需要重复使用，因此重要的是要评价NIR QD-RGD在达到医学应用目的所需的剂量下重复使用时其毒性作用。本研究用发射波长为800nm 的NIR QDs(NIR QD800) 与RGD 肽段偶联，制备NIRQD800-RGD 探针，探讨200pmol剂量的NIRQD800-RGD对小鼠行静脉单次和重复注射后是否对机体和细胞产生毒性作用，为NIR QD-RGD的进一步研究和向临床应用转化提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
QD800抗体连接试剂盒(Q22071MP，Invitrogen公司，美国)，RGD肽段(上海吉尔生化)，总蛋白定量试剂盒(A045-2)、总超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(A001)、谷胱甘肽(GSH) 测试盒(A006-1) 和丙二醛(MDA)测试盒(A003-1) (南京建成生物工程研究所)。紫外分光光度计(DU-600，Beckman公司，美国)，透射电子显微镜(H-7500，日立公司，日本)，激光光散射仪(BI-200SM，Brookhaven公司，美国)，活体成像系统(Maestro EX IVIS，CRI 公司， 美国)， 全自动血细胞分析仪(XE2100，Sysmex公司，日本)，全自动生化分析仪(ModularDDP，Roche公司，德国)，冷冻离心机(Z233MK-2，HERMLE公司，德国)，光学显微镜(E100，尼康公司，日本)。
1.2 实验动物
SPF级雄性BALB/C小鼠33只，鼠龄6～8周，体质量17～20g，购自重庆医科大学实验动物中心，恒温恒湿条件下饲养，室温(22±2)℃，空气湿度(60±10)%，垫料、饲料和饮水均经灭菌处理，饲料和水自由摄取。所有实验操作程序均经过重庆医科大学实验动物研究所实验动物使用管理委员会批准。
1.3 QD800-RGD的制备
按照QD800抗体连接试剂盒实验手册提供的实验步骤制备QD800-RGD。①量子点活化和洗脱：浓度为10mmol·L-1的双功能SMCC溶液预热15min (37℃)后取出14μL加入1.5mL的EP管内，然后加入浓度为4μmol·L-1的QD800液125μL，均匀混合，在室温下活化反应1h后用NAP-5柱子洗脱反应样本，收集有色的洗脱液约500μL。②RGD的还原和分离：RGD 肽段粉剂溶于300 μL、pH 为7.2～7.4的PBS液中，调整到浓度为1g·L-1，然后将6.1μL浓度为1mol·L-1的DTT液加入RGD溶液中，混合均匀，室温下还原反应30min后加入20μL染料指示标记液，用NAP-5柱分离反应样本，从洗脱出的第一滴着色样本开始收集，共收集500μL。③偶联和灭活：将以上收集的2种洗脱液混合均匀、室温下偶联反应1h，然后加入浓度为10mmol·L-1的2-巯基乙醇3μL，均匀混合后在室温下灭活反应30min。④浓缩和纯化：将1mL以上偶联灭活后的样本加入2个超滤离心装置管中，每个管0.5 mL，超速离心15 min(7 000r·min-1)，收集各超滤离心膜内侧20μL的偶联样本溶液，然后用Pierce柱行色谱分离，得纯化的QD800-RGD。最后根据产品说明书提供的消光系数和测量波长算出纯化的QD800-RGD浓度，其计算公式为：A=εcl(A 为吸光度值，ε为消光系数，c为分子浓度，l为光程)。
1.4 QD800-RGD和QD800特性检测
分别各取浓度为16mmol·L-1的QD800-RGD和QD800溶液50μL，用双蒸水稀释100倍，超声震荡后分别吸取各样品悬液约50μL滴到有膜的铜网上，静置10min后用滤纸吸去多余的液体，待干后用透射电子显微镜观察QD800-RGD和QD800的分散性。然后再分别取QD800-RGD和QD800各200μL于样品池内，用超纯水稀释至6mL，密封样品池后用激光光散射仪检测QD800-RGD和QD800的流体动力学直径。
1.5 QD800-RGD 和QD800在小鼠体内分布
SPF级雄性BALB/C 小鼠9只，随机分为3组，每组3只。Ⅰ组通过尾静脉注射100μL的QD800-RGD液(含200pmol QD800)，Ⅱ组通过尾静脉注射100μL (含200pmol)QD800，Ⅲ组通过尾静脉注射100μL的PBS液。24h后断颈处死小鼠，立即解剖取出脑、心、肝、脾、肺、肾、胫骨和胃，用PBS冲洗后滤纸吸干，用Maestro EXIVIS行器官的荧光成像检测(激发光：630nm;发射光：800nm)，观察QD800-RGD和QD800在小鼠以上各器官的分布。
1.6 各组小鼠全血细胞计数和血清生化分析
24只SPF级雄性BALB/C小鼠随机分成4组，每组6只。单次注射组小鼠在第1天通过尾静脉注射100μL的QD800-RGD (含200pmol QD800);单次注射对照组小鼠在第1 天通过尾静脉注射100μL的PBS;重复注射组小鼠分别在第1和7天通过尾静脉各注射100μL 的QD800-RGD (含200pmol的QD800);重复注射对照组小鼠分别在第1和7天通过尾静脉各注射100μL的PBS。每天观察1次小鼠的一般情况。第14天，将小鼠禁食不禁水12h后摘除眼球采血，每只小鼠取血约1.2mL，分别装入抗凝采血管和促凝采血管各约0.6mL。用全自动血细胞分析仪检测抗凝管全血中的白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、淋巴细胞和中性粒细胞。将促凝管中收集的血液立即离心6min (4℃、3 000r·min-1)分离得到血清，用全自动生化分析仪检测血清中总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶和血尿素氮。
1.7 各组小鼠脏器系数
24只小鼠取血后，立即脱臼处死，称体质量，然后解剖取出肝、脾、肾和肺，用滤纸吸干脏器表面的体液和血液后用电子天平称质量，小鼠的脏器系数=脏器质量(g)/体质量(g)×100%。
1.8 各组小鼠肝、脾、肾和肺组织中氧化和抗氧化指标的检测
24只小鼠的器官称质量后，立即将肝、脾、肾和肺切分为2块，将各器官的其中一块用4℃ 生理盐水冲洗3次，滤纸吸干后准确称质量，按器官质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆3min，将匀浆液低温离心10 min (4℃、3 000r·min-1)，分别各取上清液用考马斯亮蓝法检测各匀浆液的总蛋白浓度。然后用总SOD测试盒、GSH测试盒和MDA试剂盒分别测定肝、脾、肾和肺组织中的总SOD、GSH 活性和MDA含量，实验严格按测试盒说明书进行。
1.9 各组小鼠组织病理学检查
将另一块肝、脾、肾和肺组织用4%多聚甲醛固定6h后行常规石蜡包埋，切割为4μm 厚的组织切片，HE染色后采用光学显微镜观察组织病理学变化。
1.10 统计学分析
采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。全血中的白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、淋巴细胞和中性粒细胞，血清中总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶和血尿素氮，器官体质量系数，总SOD、GSH活性和MDA含量均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
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