清脑宣窍方中药有效成分和作用机理研究论文

清脑宣窍方中药有效成分和作用机理研究论文

　　1、器材

　　Waters 2695高效液相色谱仪，2696PDA检测器，自动进样；1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液质联用仪 （美国Agilent公司）；Sartorious BT 25S型1/100000电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；QL-901漩涡混和机（其林贝尔仪器制造公司）；台式高速离心机（军事医学科学院实验仪器厂），匀浆机。

　　栀子苷，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1及三七皂苷R1对照品均购自中国药品生物制品检定所（批号分别为：110749-200309，110703-200322，110745-200312，110704-200318）；人参皂苷Re，Galioside，6α－Hydroxygeniposide，3,3',5,5'-四甲氧基-4,4'-二-β-D-葡萄糖双环氧木脂素，6″－对香豆酰龙胆京尼平双糖苷，藏红花酸-1-葡萄糖（6-1）葡萄糖苷，京尼平龙胆双糖苷，2α，3β，19α，23-四羟基齐墩果-12-烯-28-酸，人参皂苷Rb2，Rb3，Rh1、Rf，Rc，Rg2，Rg3，Rd及三七皂苷fa，R4，R7及 F2对照品由北京中医药大学石任兵教授课题组提供。

　　乙腈（Fisher公司），色谱纯；屈臣氏重蒸水（液相用水）；Milli-Q系统纯化水（液质用水）；肝素、水合氯醛及甲酸为分析纯，均购自北京北化精细化学品有限责任公司。Cleanert C18 SPE固相萃取柱（3 ml，200 mg，60 μm，北京艾杰尔科技有限公司）实验对象：SD大鼠：体重（300±10）g，雄鼠［北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2007－0001］。

　　2、方法

　　2.1 给药剂量及脑组织处理方法单剂量灌服清脑宣窍有效部位（6.0 g/kg）；灌服清脑宣窍有效部位后1 h取出大脑，吸干水分，精密称重，加入脑重量两倍体积的生理盐水。以18 000 r/min匀浆，匀浆液加入两倍体积的分析甲醇，涡旋振荡10 min,混合液在6 000 r/min下离心20 min,取出上清液。残渣再加入两倍体积甲醇涡旋振荡10 min, 6 000 r/min下离心20 min,两次上清液混合，常温减压回收至干。残渣用5 ml液相水溶解，超声振荡，上SPE固相萃取柱，先用水洗脱3 ml，再用甲醇洗脱2 ml，收集甲醇洗脱液，常温减压干燥，残渣加甲醇300 μl 漩涡溶解，即得供试品溶液。

　　2.2 HPLC-MS条件色谱柱：

　　Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；保护柱：Eclipse XDB-C18；柱温：30℃；流速：1.0 ml /min；检测波长：203，238nm；乙腈（A）-酸水（B）二元梯度洗脱，梯度为：5%A17 min →16%A23 min →16%A28 min →20%A34 min →22%A50 min →30%A65 min →45%A80 min →100%A。1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液质联用仪：质谱（MS）条件：ESI离子源；离子源温度350℃；毛细管电压：3 000 eV；负离子检出模式；雾化气压力：60 psi；干燥气：N2；流速：12 L/min；扫描范围：200～1 800 m/z。

　　传统中药研究与现代分析技术手段结合，是中药现代化的必须［7］。一个疗效确切的复方进入人体内的成分谱中多数成分是否存在对疾病的'多靶点基因表达的调控作用，必须建立在确认该成分（代谢产物）在靶器官内是否存在的基础上，再进行体内外药效学研究。

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