开口箭活性部位抗肿瘤细胞作用研究论文

　　1 材料与仪器

　　1.1 细胞株人宫颈癌细胞（Hela）、人肝癌细胞（HepG2）均由三峡大学分子生物学研究所提供。

　　1.2 药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品；四氮唑蓝（MTT）为美国AMRESCO公司产品；环磷酰胺 （CP,江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：07020121）。酶联免疫检测仪（GENIOS TECAN）；CO2培养箱（日本三洋公司）；LD4-2A离心机（北京医用离心机厂）；96孔板（美国Cornning公司）。开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（No.TC200207SNJ）。

　　2 方法

　　2.1 药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，浓缩后经氯仿脱脂后用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭4部分皂苷。分别取开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷两个样品，用PBS配制成所需浓度，依次为312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%开口箭皂苷用PBS配制成所需浓度，依次为156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。环磷酰胺 （CP）用DMSO将其配置为500 mg/ml。

　　2.2 细胞培养 Hela和HepG2细胞用RPMI-1640培养液（另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　2.3 开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择MTT法实验条件的初步优化，主要是对溶解药物的溶剂（水、PBS）、加药前的培养时间（6，12，24 h）、药物剂量和细胞密度进行了摸索。其中密度细胞分别取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml,接种于96孔培养板，每孔接种100 μl，转板24 h后加不同浓度的开口箭活性部位，继续培养48 h，以MTT法测定吸光度，比较不同细胞密度的线性关系。

　　2.4 MTT比色法［6］MTT比色法按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×105个/ml,接种于96孔培养板，每孔接种100 μl，转板24 h后加100 μl受试药，另设阴性对照组（不加药）、空白调零组（只有PBS）和阳性对照组（环磷酰胺组），每组均设3个复孔，培养48 h，吸弃上清后加MTT（5 mg/ml）100 μl,继续培养4 h后，弃去上清液，加DMSO 100 μl,用全自动酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定吸光度（OD）值［7］，求出IC50。抑制率（%）=［阴性对照A570- 加药组A570］/ 阴性对照A570×100%。

　　2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分1×106个细胞于培养瓶，阴性对照组0.5×106个细胞每瓶，培养24 h；吸弃部分上清后加药混匀（开口箭总皂苷、30%皂苷终浓度2 500μg/ml，70%皂苷和环磷酰胺终浓度1 250 μg/ml），继续培养48 h；于5%CO2培养箱中培养48 h后，收集上清于相应标签离心管中，各加1 ml胰酶消化，加4 ml培养液于该培养瓶中，并一起吸至各相应离心管中，各瓶加入5 ml PBS洗涤，洗涤液一起吸入相应离心管中，以2 000 r/min离心5 min；吸弃上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA（Na）2的PBS混合液悬起细胞，轻轻混匀，于4℃固定30 min；弃上清，加PBS 10 ml混匀，以2 000 r/min离心5 min；用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS悬起细胞，转置测定管中，加溴化丙锭PI 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；滤膜过滤后上机。

　　3 结果

　　开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的'选择为了得到相对稳定并且可靠的实验结果，通过前期预实验并结合大量资料，对该MTT法实验条件进行了初步优化，主要是对溶解药物的溶剂、加药前的培养时间、药物剂量和细胞密度进行了探索。对于溶剂，最初采用的溶剂是水，通过对照发现溶解药物的水对细胞的影响很小，但并非没有，所以正式实验采用PBS溶解药物；对于加药前的培养时间采用了6，12，24 h 3个时间，通过显微镜观察发现加药前培养24 h细胞状态良好，由此选用了加药前培养24 h；

　　对于药物剂量，通过多次预实验，最终选择了最高浓度开口箭总皂苷、30%皂苷为10 000 μg/ml，70%皂苷为5 000 μg/ml，而环磷酰胺为20 000 μg/ml；对于细胞密度，通过多次预实验，采用5种细胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml，同样的药物浓度情况下，开口箭活性部位对Hela细胞生长抑制呈最好线性关系的细胞密度是0.5×105 个/ ml，由此选择最佳细胞浓度是0.5×105个/ml。通过这些因素的优化，从而初步排除了其他非药物因素对细胞的影响；而且这两种肿瘤细胞的MTT实验在同一批进行实验，排除了不同环境的干扰，从而得出实验结果。

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