克隆生物技术论文

　　克隆原指以幼苗或嫩枝插条，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。下面是小编为大家精心推荐的克隆生物技术论文，希望能够对您有所帮助。

　　猪USF1基因克隆与序列分析

　　摘要：研究克隆了猪USF1基因1 382 bp的cDNA序列(登录号：EF 219407)和5 516 bp的DNA序列(登录号：EF 625885)。序列分析发现猪USF1基因编码区序列与人、小鼠的同源性分别为99%和98%。基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子，内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。

　　关键词：猪;USF1基因;克隆;序列分析

　　中图分类号：S828;Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2013)24-6175-03

　　上游刺激因子1(Upstream stimulatory factor 1，USF1)是螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(HLH- LZIP)转录因子家族成员之一[1]，可以与USF2形成二聚体，并能识别DNA的E-box序列，调节基因转录[2]。人类USF1基因位于1q22-q23[3]，并广泛表达于机体的各个组织，调控糖和脂肪代谢基因的表达[4]，此外USF1基因还具有调节免疫反应和细胞周期的功能[5]。研究发现USF1基因可以作为调节治疗人的胰岛素抵抗葡萄糖不耐症、II型糖尿病和向心型肥胖易感症的候选基因[6-9]。本研究利用EST信息和测序的方法克隆了猪USF1基因并进行了序列分析，为进一步研究该基因对猪生长发育的调控机理具有重要的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　采集4月龄大白猪(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场)的肌肉组织，用液氮速冻置于

　　-70 ℃中，利用TRizol法提取总RNA，反转录得到cDNA。利用DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA，贮存于-20 ℃。

　　pMD-18T vector system、DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司;Gel Extraction Kit购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

　　1.2 引物设计

　　以人的基因序列为探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列，筛选猪的同源性EST(标准：长度≥200 bp，相似性≥80%)，用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接，参照拼接的contig(重叠群)采用Primer5.0软件设计引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列。参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6对引物(表1)扩增USF1基因的.序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

　　1.3 PCR扩增与测序

　　PCR扩增体系为25 μL，包括50 ng 模板DNA、2.5 mmol/L 1×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、0.5 mmol/L PCR primers、2 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性45 s，退火(温度、时间根据引物来确定)，72 ℃延伸90 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，与pMD-18T vector system连接，并转化大肠杆菌DH5α，将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。

　　2 结果与分析

　　2.1 RT-PCR扩增USF1基因

　　以大白猪cDNA为模版，利用引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R均扩增出了特异带，RT-PCR扩增产物结果如图1所示。将PCR产物回收、纯化、克隆测序，测序结果显示引物U1F/U1R扩增产物长度为613 bp(图1a)，引物U2F/U2R扩增产物长度为312 bp(图1b)，引物U3F/U3R扩增产物长度为520 bp(图1c)。

　　2.2 猪USF1基因的cDNA序列同源性分析

　　利用DNAStar软件的SeqMan程序将RT-PCR扩增得到的片段进行拼接，得到一条长1 382 bp的 cDNA序列。将获得的猪USF1基因的cDNA序列分别与人USF1基因cDNA序列(NM_007122)和小鼠序列(NM_009480)进行比对。结果表明，猪与人、小鼠的同源性分别为99%和98%，确定所获取的序列为猪的USF1基因，提交到GenBank，得到登录号为EF 219407。

　　2.3 猪USF1与部分物种USF1的进化关系

　　利用GenBank已有的USF1蛋白质序列： NP_001001161(USF1，Cattle)，NP_001007486(USF1， Gallus)，NP_009053(USF1，Human)，NP_033506 (USF1， Mouse)， NP_113965(USF1，Rat)以及猪USF1基因编码的氨基酸序列， 利用ClustalW软件对6个物种的USF1氨基酸序列进行了序列比对，结果发现猪与人和牛的同源性达到了99%，与小鼠和大鼠的同源性达到了98%，并构建了系统进化树(图2)。

　　2.4 猪USF1基因组序列的克隆和序列分析

　　根据人的cDNA序列和人的基因组序列比对结果，预测的猪USF1基因内含子，参照分离得到的基因序列，设计U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R和U9F/U9R等6对引物，以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增猪USF1基因的10个内含子序列，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图3。

　　引物U4F/U4R在猪基因组中的扩增片段长度是2 094 bp，其中第1内含子的长度为2 007 bp;引物U5F/U5R在猪基因组中的扩增片段长度740 bp，其中第2，3内含子的长度分别为363 bp和157 bp;引物U6F/U6R在猪基因组中的扩增片段长度783 bp，其中第4，5内含子的长度分别为301 bp和241 bp;引物U7F/U7R在猪基因组中的扩增片段长度600 bp，其中第6，7内含子的长度分别为249 bp和135 bp;引物U8F/U8R在猪基因组中的扩增片段长度656 bp，其中第8，9内含子的长度分别为153 bp和249 bp;引物U9F/U9R在猪基因组中的扩增片段长度690 bp，其中第10内含子的长度为192 bp。利用DNAStar软件的SeqMan程序将扩增得到的片段进行拼接，得到一条5 516 bp的DNA序列，将序列拼接提交到GenBank收录号为EF 625885。基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子，内含子的剪接方式都符合“GT-AG”法则。   3 小结与讨论

　　本研究中猪USF1基因的cDNA序列与人和小鼠的同源性分别为99%和98%;编码区的高度保守性证实了所分离基因的正确性，同时也为利用小鼠等模式动物的基因信息来进行畜禽基因组学的研究提供依据。

　　脊椎动物间的基因序列具有高度的保守性，根据已知物种的基因组序列，可以预测其他物种同源基因的基因序列。本研究利用人USF1基因序列，预测了猪USF1基因序列，并通过试验获得了相应的基因组序列。测序结果表明，所获得的候选基因的内含子和外显子组成及相对位置与预测结果一致，且内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。

　　参考文献：

　　[1] GREGOR P D， SAWADOGO M， ROEDER R G， et al. The adenovirus major late transcription factor USF is a member of the helix-loop-helix group of regulatory proteins and binds to DNA as a dimer[J]. Genes Dev，1990，4(10)：1730-1740.

　　[2] SIRITO M， WALKER S， LIN Q， et al. Members of the USF family of helix-loop-helix proteins bind DNA as homo- as well as heterodimers[J]. Gene Expression，1992，2(3)：231-240.

　　[3] SHIEH B H， SPARKES R S， GAYNOR R B， et al.Localization of the gene-encoding upstream stimulatory factor (USF) to human chromosome 1q22-q23[J]. Genomics，1993，16(1)：266-268.

　　[4] LEE J C， LUSIS A J， PAJUKANTA P. Familial combined hyperlipidemia： Upstream transcription factor 1 and beyond[J]. Current Opinion in Lipidology，2007，17(2)：101-109.

　　[5] TERRAGNI J， NAYAK G， BANERJEE S， et al.The E-Box binding factors Max/Mnt， MITF and USF1 Act coordinately with FoxO to regulate expression of Pro-apoptotic and cell cycle control genes by phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/GSK3 signaling[J]. Journal of Biological Chemistry，2011，286(42)：36215-36227.

　　[6] PAJUKANTA P， LILJA H E， SINSHEIMER J S， et al.Familial combined hyperlipidemia is associated with upstream transcription factor 1(USF1)[J].Nature Gene，2004，36(4)：371-376.

　　[7] KOMULAINEN K， ALANNE M， AURO K， et al.Risk alleles of USF1 gene predict cardiovascular disease of women in two prospective studies[J]. Plos Genetics，2006，2(5)：672-681.

　　[8] COON H， XIN Y， HOPKINS P N， et al.Upstream stimulatory factor 1 associated with familial combined hyperlipidemia， LDL cholesterol， and triglycerides[J]. Humman Genet，2005，117(5)：444-451.

　　[9] SANCHEZ A P， ZHAO J H， YOU Y， et al. Role of the USF1 transcription factor in diabetic kidney disease[J]. American Journal of Physiology-Renal Physiology，2011，301(2)：271-279.

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