丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)和人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)的传播途径十分相似，约30%的HIV阳性患者合并HCV感染。在中国的静脉药瘾的HIV感染者中，HCV阳性率可高达90%。HCV患者合并感染HIV将加速丙型肝炎病程进展，同时降低抗HCV疗效。近年较多研究表明，对合并感染患者针对HIV进行严格的高效抗逆转录病毒治疗(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)不能有效地改善这些情况，同时HCV病程加速也与CD4+T淋巴细胞数量下降无明显关联。我们前期的研究也证实，HIV合并感染可能导致患者体内HCV准种分布特征改变，但HCV载量及准种复杂度与CD4+T淋巴细胞数量无关。以上证据提示HIV对HCV的影响可能存在其他途径。有研究证实HCV、HIV可以共感染同一肝细胞，进而可能导致两种病毒在同一细胞内发生相互作用。HCV、HIV均为RNA病毒，而DDX3在人体细胞内与RNA的复制过程关系密切，已有研究证实DDX3可与HCVCore蛋白结合促进HCV的复制。同时发现HIV-1Rev蛋白可与DDX3结合在核膜上形成复合体从而导致细胞质内DDX3的水平下降，也有研究表明，Rev蛋白可以与HCV5'-UTR作用直接促进HCV的复制。但是尚未有研究证实Rev蛋白可以通过间接作用影响HCV的复制，或通过影响其他细胞代谢途径影响HCV的复制，也没有研究证实Rev蛋白和DDX3可以共同作用并对HCV的复制产生影响。
本实验通过分别构建HCVRNA复制细胞模型及表达DDX3、Rev+DDX3的HCVRNA复制细胞模型，研究Rev蛋白和DDX3对HCVRNA复制的影响。旨在为进一步深入研究Rev蛋白和DDX3是否通过共同作用，从而影响HCVRNA复制。
1材料与方法
1.1材料
Huh7肝癌细胞系和HCV复制模型pCDNA3.1-JFH1均为本实验室保存，Huh7细胞系生长于含10%灭活小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、氨苄青霉素(100U/mL)、链霉素(100U/mL)和DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。实验中主要材料包括:真核过表达质粒pCDNA3.1(鼎国生物技术有限公司，北京)，各种工具酶、核酸标准分子量Marker以及蛋白质预染Marker(天根生化有限公司，北京)，去内毒素质粒大量提取试剂盒(Qiagen公司，德国)，质粒转染转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen公司，美国)，鼠抗Flag单克隆抗体(Sigma公司，美国)、兔抗人GAPDH单克隆抗体、小鼠抗人DDX3单克隆抗体、小鼠抗HIVRev单克隆抗体(Abcam公司，美国)，HRP标记的羊抗兔IgG二抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗(福州迈新公司中国)，qPCR引物由Invitrogen公司合成。
1.2方法
1.2.1含Rev、DDX3基因重组真核表达载体的构建查询NCBI获得Rev蛋白和DDX3的基因表达序列，并分别在其基因的5'端引入限制性酶切位点EcoRⅠ和增强表达的Kozak序列，3'端引入限制酶切位点XbaⅠ和便于Rev、DDX3表达检测的Flag标签蛋白(DYKDDDDK)编码序列，以及便于观察转染效率的mCherry和YFP序列。以上相关基因序列由深圳华大生物科技有限公司协助合成。进一步分别将各自基因序列插入真核过表达载体pCDNA3.1中命名为pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag。从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI软件进行PCR引物设计。载体pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry正向引物(5'-AGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGAGCCAGTAGATCCTAG-3')(含同源重组序列、EcoRⅠ酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5'端配对序列)，(5'-TAGTCCATGGTGGCGAATTCTTCTTTAGTTCCTGACTCCAATAC-3')(含同源重组序列、EcoRⅠ酶切位点，并含有目的基因3'端配对序列)。载体pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag正向引物5'-ACGATGACGATAAGCTCGAGGCCACCATGAGTCATGTGGCAGTGG-3'(含同源重组序列、XhoⅠ酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5'端配对序列)，反向引物5'-GTTTAAACGGGCCCTCTAGATCAGTTACCCCACCAGTCAAC-3'(含同源重组序列、XbaⅠ酶切位点，并含有目的基因3'端配对序列)。
1.2.2重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒的鉴定用构建好的重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFPFlag质粒分别转化入大肠杆菌DH5α中，均匀涂布接种于含有氨苄青霉素的琼脂糖平板上，次日挑取阳性单克隆菌落摇菌扩增后，抽提质粒进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物进行回收，并进行核酸测序。
1.2.3重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag及pCDNA3.1-JFH1质粒的转染采用Lipofectamine2000转染试剂，实验步骤按照使用说明书进行操作。将重组pCDNA3.1-Rev-FlagmCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒分别瞬时转染入Huh7细胞中，通过荧光显微镜观察转染效率。pCDNA3.1-JFH1瞬时转染入Huh7细胞中，qPCR检测HCV的复制情况。
1.2.4Westernblot鉴定Rev、DDX3基因在Huh7细胞中的表达分别转染48h后，提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳。在4℃下、300mA恒流条件下电转120min，用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST)室温封闭PVDF膜1h，TBST洗膜3次，每次10min，一抗加入1∶5000比例稀释的anti-Rev单克隆抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10min，二抗加入1∶5000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育2h，TBST洗膜3次，每次10min。化学发光试剂检测，以GAPDH为内参。
1.2.5qPCR检测细胞内Rev、DDX3对HCV复制的影响用Lipofectamine2000转染试剂，实验按照使用说明书进行操作。将pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1瞬时共转染入Huh7细胞中，qPCR检测HCV复制情况。将pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag及pCDNA3.1-JFH1瞬时共转染入Huh7细胞中，qPCR检测HCV复制情况。查询NCBI中HCV基因组序列，以5'非翻译区为模板设计引物，引物序列为HCV-F:5'-CCCTGTGAGGAACTACTGTCTT-3';HCV-R:5'-TGAGCGGGTTTATCCAAG-3'。引物序列由美国Invitrogen公司合成。扩增条件为95℃预变性1min，95℃变性10s，58℃退火扩增30s，循环40次，最后添加65～95℃溶解曲线。标准曲线:取1μgPCDNA3.1-JFH1按10倍梯度稀释5个梯度后按上述体系进行Real-timePCR检测，最终将每个梯度的Ct值带入对应终浓度计算函数，最终以该函数计算每个样品中对应的HCV复制水平。
1.3统计学处理
采用SPSS17.0进行统计，实验组与对照组采用两独立样本t检验检测均值是否有显著性差异。
2结果
2.1重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag真核表达载体的鉴定含pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherryg质粒的菌液经扩增培养后提取纯化质粒，进行PCR鉴定，产物经5%琼脂糖凝胶电泳，分别出现1条特异性条带，均位于400bp附近。核酸序列测定结果显示，克隆的外源基因全长394bp。含pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒的菌液经扩增培养后提取纯化质粒，进行PCR鉴定，产物经5%琼脂糖凝胶电泳，分别出现2条特异性条带，分别位于2000bp附近，选择与预期产物大小接近的条带进行胶回收并测序。核酸序列测定结果显示，克隆的外源基因全长2035bp。通过对克隆的外源基因序列测序并和GenBank中Rev和DDX3序列对比，证实其基因序列100%同源，提示Rev和DDX3真核表达载体构建成功。
2.2Rev、DDX3基因分别在Huh7细胞中的表达重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒分别转染Huh7细胞，转染24h后用荧光显微镜观察荧光，可见Rev在荧光显微镜下发红光，DDX3在荧光显微镜下发黄光;转染48h后提取细胞总蛋白，通过Westernblot检测Rev蛋白和DDX3的表达，凝胶成像仪成像结果证明重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒能在Huh7细胞中表达相应的蛋白。
2.3DDX3对细胞HCV复制的影响重组pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1质粒共转染Huh-7细胞，48h后用TRIzol法提取细胞总RNA，qPCR检测HCV的复制水平，进行对照组与实验组的两独立样本t检验。结果表明，瞬时转染DDX3和HCV复制质粒后，HCV的复制水平(1.09×107±0.18×107)明显高于HCV复制质粒单独转染后的HCV复制水平(4.79×106±1.24×106)(P=0.03)。提示，DDX3可以增强HCV在细胞中的复制。
2.4Rev和DDX3共同作用对细胞HCV复制的影响重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1质粒共转染入Huh-7细胞中，转染48h后，提取细胞总RNA，进行qPCR检测HCV的复制水平，进行对照组与实验组的两独立样本t检验。结果表明，Rev、DDX3和HCV复制质粒共转染Huh-7细胞后，HCV的复制水平(1.74×107±0.40×107)明显低于HCV单独转染后的HCV复制水平(4.17×107±0.46×107)(P<0.001)。Rev蛋白和DDX3共同作用可以抑制HCV的复制。
3讨论
有研究证实循环血液中的HIVgp120蛋白在与肝细胞表面CCR5和CXCR4接触后可激活肝细胞内TGFβ-1表达从而促进肝细胞内HCV的复制。有研究发现可以从CD4-CXCR4+的原代肝细胞中成功分离出HIV;并且Fromentin证实CD4-CXCR4-的某些肝癌细胞株也可以感染HIV。证明HIV和HCV可共感染同一肝细胞，表明二者有产生直接作用的可能。在HIV、HCV共感染的患者中，HIV可以促进HCV的复制，而且加速肝纤维化的进程。HIV合并HCV感染患者与HIV单独感染患者比较，肝脏相关疾病是非AIDS引起死亡的主要原因。最新的研究表明，HIV和HCV合并感染加速疾病的进程，特别是HIV感染增加HCV的复制、肝细胞凋亡、肠道微生物的移位、损伤HCV的特异性免疫应答。对HIV合并HCV的患者分别进行HIV的抗病毒治疗和HCV的抗病毒治疗，结果表明抗病毒治疗有效的延缓了肝纤维化的进程并减少了HIV合并HCV感染的患者终末期肝病的并发症。然而HIV合并HCV感染的患者接受常规的PEG-IFN联合利巴韦林治疗所产生的持续性病毒学应答要比单独HCV患者有明显的降低。
有研究表明，在HIV-1致病过程中，Rev蛋白发挥着重要作用，其可以促进HIV-1病毒颗粒的产生，并可以抑制病毒所有调节蛋白的产生。因HIV和HCV在细胞复制中无法自身合成RNA解旋酶，其在细胞中的复制需要细胞内的RNA解旋酶参与。DDX3属于DEAD解旋酶家族，DDX3参与多种细胞进程，包括mRNA的剪接和转录、翻译的起始和RNA的转运。有研究显示，DDX3可以与HIV-1中的Tat蛋白作用，刺激病毒mRNA的翻译，也可以和Rev蛋白作用参与REV-RRE介导的输出作用。有研究表明DDX3与HCVCore蛋白结合促进HCV的复制。同时也有学者发现HIV-1Rev蛋白可与DDX3结合在核膜上形成复合体从而影响细胞质内DDX3的水平。也有研究发现Rev蛋白可以与HCV5’-UTR作用直接促进HCV的复制。但是尚未有研究证实Rev可以通过间接作用影响HCV的复制，也没有研究证实Rev蛋白和DDX3共同作用对HCV的影响。
本研究证实pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag可以在真核细胞中表达;转染后48hqPCR检测发现，DDX3单独与HCV作用时，可以促进HCVRNA的复制;当Rev和DDX3共同作用于HCV时，可以有效抑制HCVRNA的复制。可能原因:①Rev和DDX3在细胞中结合形成复合物，降低了细胞内DDX3的水平，降低了DDX3对HCVRNA的复制作用，从而竞争性抑制了DDX3对HCV复制的影响;②也有可能通过抑制某些信号通路从而影响HCVRNA的复制，因为Rev和DDX3不仅在HCV的表达中起作用，而且参与细胞中的多种信号通路，Rev和DDX3形成复合物后也抑制了相应的信号通路，导致HCVRNA的表达量下降;③或者改变了Rev和DDX3在细胞中的分布，导致它们无法在指定的作用位点与HCV进行相互作用，从而导致HCVRNA表达量的下降。
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