原发性高血压是发病率较高的常见疾病。发病率呈逐年上升趋势，若不及时治疗，可发展为慢性肾衰竭或尿毒症而危及生命。目前，高血压肾病机制尚不十分清楚，其主要的病理改变为肾间质纤维化与肾小球硬化。其中肾间质纤维化是决定肾脏疾病发展和预后的重要因素，是所有原发或继发慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同途径。芝麻素( sesamin，Ses) 是从芝麻中提取出来的有效活性成分，具有调节血压、血脂，保护与改善肝肾功能及抗肿瘤等药理作用。本课题组前期研究已证实，Ses 具有减轻自发性高血压大鼠肾损伤的保护作用，但深入的机制尚不清楚。本实验以自发性高血压大鼠( SHR) 为研究对象，探讨Ses 减轻大鼠肾脏纤维化的作用及其可能存在的机制。
1 材料与方法
1. 1 药品和试剂
芝麻素( 分子式C20H15O6，相对分子质量354. 34，纯度≥98%) ，购自上海纯优生物科技有限公司; 卡托普利片( 批号:13030711) ，购自常州制药厂有限公司; 丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、BCA( bicinchoninicacid) 蛋白浓度检测试剂盒、α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA，批号: AA132) 抗体均购自碧云天生物技术研究所; 转化生长因子-β1( TGF-β1，批号:BA0290 ) 、基质金属蛋白酶-9 ( MMP-9，批号:BA2202) 、基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1( TIMP-1，批号: BA3727) 抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1. 2 仪器
ALC-NIBP 无创尾动脉血压测定分析系统( 上海奥尔科特生物科技有限公司) ; DYCP-34A 型电泳槽、DYY-Ⅲ-8B 稳压稳流电泳( 北京六一仪器厂) ; Mini PROTEAN 转膜系统、MiniPROTEAN 电泳系统( 美国Bio-Rad 公司) ; CS-15台式离心机( Beckman Coulter) ; SIEMENS RXLMAX全自动生化仪( 上海西门子有限公司) 。
1. 3 实验
动物及分组10 周龄雄性SHR 大鼠28 只，WKY 大鼠7 只，体质量180 ～ 200 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号为SCXK ( 沪) 2012-0002， 合格证号为2007000552035。大鼠每4 只1 笼进行饲养，自然光照，室温( 23 ± 2) ℃，相对湿度60% ～ 65%，动物可自由进食饮水。SHR 大鼠适应性喂养3周后，随机分为4 组: 模型( SHR) 组、芝麻素低、高( 80、160 mg /kg) 剂量组及卡托普利( 30 mg /kg)组，以同周龄WKY 大鼠作为对照组。按上述设定剂量灌胃给药，每日一次，连续12 周。
1. 4 测量
血压采用尾动脉无创测压法。在干燥、安静的环境中，将清醒状态下的大鼠放置于37 ℃ 恒温袋内预热15 min，用ALC-NIBP 无创血压计测量尾动脉舒张压，在大鼠安静状态下连续测定3 次，每次间隔1 ～ 2 min，取其平均值。
1. 5 生化指标检测
全自动生物化学分析仪测定各组大鼠血清肌酐( Scr) 、尿素氮( BUN) 和尿微量白蛋白( U-mAlb) 含量; 黄嘌呤氧化酶法测定SOD; 硫代巴比妥酸法测定MDA。具体方法、操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1. 6 肾脏病理学变化
观察给药12 周后， 10%水合氯醛( 0. 33 g /kg，i . p. ) 麻醉各组大鼠，取肾脏组织，置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化等，进行HE 和Masson染色，光镜下观察肾脏病理学变化。
1. 7 免疫组织化学法测
TGF-β1、α-SMA 阳性细胞的表达按照厚度约为5 μm/片的标准将各组大鼠肾脏石蜡横断面连续切5 ～ 6 片，切片常规脱蜡至水。严格按照免疫组化试剂盒说明书操作。将免疫组化染色的切片在光镜下统一放大10 ×40 倍，采用Image-pro plus 图像分析软件进行半定量分析，将每只大鼠肾组织染色切片各取5 个相同单位面积的区域，棕黄色颗粒为阳性细胞，测定TGF-β1及α-SMA 阳性细胞的积分光密度值( IOD) ，计算其平均积分光密度值( AIOD) 。
1. 8 Western blot 测TGF-β1、α-SMA、MMP-9、TIMP-1 蛋白的表达
RIPA 裂解液裂解肾组织，提取细胞总蛋白，BCA 法测蛋白浓度，每孔上样50 μg 蛋白，SDS-PAGE( 12%) 电泳分离样品。电泳后的蛋白转移至PVDF 膜上，室温下封闭液封闭1 h，一抗孵育( 4 ℃) 过夜。然后用洗涤液洗膜10 min × 3 次，再将膜浸入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG( H + L) ( 1∶ 2 000) 中，室温下孵育60 min，洗膜10 min × 3 次，ECL 发光显色，曝光、显影及定影，采用Image J 1. 43 软件进行数据处理，条带强度用集成光密度值表示。( 目的蛋白集成密度值/β-actin 集成密度值) 为目的蛋白表达强度。
1. 9 统计学处理结果
采用SPSS 13. 0 软件进行分析，所有数据均以均数± 标准差( x ± s) 表示，2 组间比较，方差不齐用t' 检验，方差齐用非配对t 检验，多组比较采用单因素方差分析( ANOVA)分析。P < 0. 05 为组间差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 芝麻素对SHR 大鼠舒张压的影响给药前，各组SHR 大鼠舒张压均明显高于正常组( P< 0. 01) 。当模型组大鼠给药治疗后，在12 周内其舒张压随时间的延长逐渐下降，尤其在给药第8 周后，与模型组比较，芝麻素各剂量组与卡托普利组大鼠舒张压明显下降( P < 0. 01) 。提示芝麻素具有一定降低SHR 大鼠血压的作用。
2. 2 芝麻素对SHR 大鼠生化指标的影响与正常组比较，模型组大鼠Scr、BUN、U-mAlb 及MDA含量明显升高，SOD 水平显著降低( P < 0. 01) 。与模型组相比，芝麻素低、高剂量组及卡托普利组Scr、BUN、U-mAlb、MDA 含量均显著下降，SOD水平明显提高( P < 0. 05，P < 0. 01) ，其中芝麻素高剂量组与卡托普利组效果更明显 。提示芝麻素具有减轻SHR 大鼠肾损伤的作用，可能与其抗氧化应激作用有关。
2. 3 芝麻素对SHR 大鼠肾脏形态学的影响正常组肾小球和肾小管结构均正常。与正常组比较，HE 结果显示模型组大鼠肾小球系膜区基质增多，肾小管上皮细胞出现颗粒变性伴萎缩，肾间质发生纤维化伴淋巴-单核细胞浸润; Masson 染色结果显示肾小球系膜区与肾小管周围出现大量蓝染胶原沉积，纤维增生和间质纤维化。与模型组相比较，用药组HE、Masson 染色均显示肾小球系膜基质增生和肾小管上皮细胞变性明显减少，胶原沉积和肾间质纤维化程度显著减轻。提示芝麻素具有一定改善SHR 大鼠肾脏纤维化的作用。
2. 4 芝麻素对SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达的影响正常组大鼠肾小管上皮细胞、基膜和肾间质中，极少表达TGF-β1、α-SMA，仅见很少量的棕黄色颗粒沉积; 模型组TGF-β1阳性细胞表达主要在肾小管上皮细胞，可见大量棕黄色颗粒沉积，α-SMA 阳性细胞表达主要在肾小管基膜及肾间质中，出现大量棕黄色颗粒沉积; 而用药组肾小管基膜、上皮细胞及肾间质中棕黄色颗粒沉积明显减少。半定量分析结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达明显增强( P < 0. 01) ; 而与模型组相比，芝麻素、卡托普利能不同程度地减弱大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达( P<0. 05，P < 0. 01) 。提示芝麻素具有下调SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 阳性细胞表达的作用。
2. 5 芝麻素对SHR 大鼠肾组织TGF - β1、α-SMA 蛋白表达的影响模型组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白表达水平与正常组比较，显著增加( P < 0. 01) ; 而与模型组相比，芝麻素与卡托普利能不同程度地降低SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白表达水平，差异具有显著统计学意义( P < 0. 05，P < 0. 01，图4) 。提示芝麻素可下调SHR 大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白的表达水平。
2. 6 芝麻素对SHR 大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1 蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1 蛋白表达水平增强，尤其是TIMP-1 表达显著增强，MMP-9 /TIMP-1 比值明显降低( P < 0. 01) ; 与模型组比较，芝麻素高剂量组及卡托普利组大鼠肾脏MMP-9、TIMP-1 蛋白表达水平降低，且TIMP-1 表达水平下降更显著，MMP-9 /TIMP-1 比值明显增大( P < 0. 05，P<0. 01) 。提示芝麻素能下调SHR 大鼠肾组织MMP-9 和TIMP-1 蛋白的过度表达，尤其下调TIMP-1 表达更为显著，增大MMP-9 /TIMP-1 比值。
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